一、貼壁細(xì)胞的TUNEL染色

1.取待測的細(xì)胞爬片，用新鮮配制的×1PBS清

洗，室溫，3分鐘×3

2.用4%多聚甲醛固定，室溫，25分鐘。

3.用新鮮配制的×1PBS清洗，室溫，5分鐘×2次。

4.細(xì)胞爬片浸入0.2%TritonX-100(×1 PBS配制）溶液中，室溫，5分鐘。

5.浸入新鮮配制的×1PBS中清洗，室溫，5分鐘× 2次。

6.移去細(xì)胞爬片上多余的液體，滴加

equilibration buffer，每張片子100ul，室溫孵育5~10分鐘。

7.配rTdT反應(yīng)液，每張細(xì)胞片100 ul

(equilibration buffer 98 μI+biotinylated

nucleotide mix 1 μl+rTdT enzyme 1ul)。

8.移去細(xì)胞爬片上多余的液體，每張細(xì)胞片滴加

100 μlrTdT反應(yīng)液（避免細(xì)胞片變干），放人濕盒中，37℃，60分鐘。

9.用去離子水稀釋× 20 SSC至×2SSC

(1:10)，傾去rTdT反應(yīng)液，滴加×2SSC,室

溫，15分鐘，終止反應(yīng)。

10.浸入×1PBS（新鮮配制）中清洗，去除未結(jié)合的生物素化的核苷酸，室溫，5分鐘×3次。

11.浸入0.3%H202，溶液中，室溫，3~5分鐘，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的作用。

12.浸入×1PBS（新鮮配制）中清洗，室溫，5分鐘×3次。

13.用×1PBS稀釋streptavidin HRP

(1:500)，每張細(xì)胞片加100ul，室溫孵育，30分鐘。

14.浸入×1 PBS（新鮮配制）中清洗，室溫，5分鐘×3次。

15.配制DAB使用液(50 μl20×DAB substrate

buffer+950μl去離子水+50 ul 20×DAB

chromogen+50ul × 20 H202)，避光，滴加100μlDAB使用液至細(xì)胞片，顯色，直到淺棕褐色背景出現(xiàn)，避免背景顏色過深。

16.去離子水清洗數(shù)次，脫水，透明，封片，鏡下觀察。

文章出自：TUNEL    想了解更多請(qǐng)關(guān)注：http://bocs.com.cn/