（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

利用抗原與抗體的特異性結(jié)合原理，檢測(cè)組織中特定蛋白質(zhì)的表達(dá)位置、表達(dá)強(qiáng)度，為病理分型、疾病診斷及預(yù)后評(píng)估提供分子水平依據(jù)。

（二）實(shí)驗(yàn)材料

1.  樣本：已烤好的病理石蠟切片；2.  試劑：3%過(guò)氧化氫溶液、抗原修復(fù)液（檸檬酸鹽緩沖液，pH6.0）、封閉液（山羊血清）、一抗、二抗（熒光標(biāo)記或酶標(biāo)）、DAB顯色液、蘇木素染液（復(fù)染用）、梯度酒精、二甲苯、中性樹(shù)膠；3.  儀器：微波爐、恒溫孵育箱、染色架、染色缸、顯微鏡、濕盒、移液器。

（三）實(shí)驗(yàn)步驟

1. 脫蠟至水：同HE染色步驟，二甲苯脫蠟2次（各10分鐘）→梯度酒精脫水（無(wú)水乙醇→95%→90%→80%→70%，各5分鐘）→自來(lái)水沖洗5分鐘。

2. 滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：將切片放入3%過(guò)氧化氫溶液中，室溫孵育10-15分鐘，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，避免干擾顯色結(jié)果，然后用PBS緩沖液（pH7.4）沖洗3次，每次5分鐘。

3. 抗原修復(fù)：將切片放入檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）中，置于微波爐中加熱至沸騰，保持中低火加熱10分鐘，然后自然冷卻至室溫（抗原修復(fù)可使組織中被石蠟包埋的抗原暴露，增強(qiáng)抗原與抗體的結(jié)合能力），再用PBS沖洗3次，每次5分鐘。

4. 封閉：將切片放入濕盒中，滴加適量封閉液（山羊血清），室溫孵育30分鐘，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景染色，孵育后無(wú)需沖洗，吸去多余血清即可。

5. 一抗孵育：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，用抗體稀釋液稀釋一抗（稀釋比例按抗體說(shuō)明書(shū)調(diào)整，一般1:100-1:500），滴加在切片上，置于濕盒中，4℃冰箱孵育過(guò)夜（或室溫孵育2小時(shí)，4℃孵育效果更穩(wěn)定，特異性更強(qiáng)）。孵育完成后，用PBS沖洗3次，每次5分鐘，去除未結(jié)合的一抗。

6. 二抗孵育：滴加對(duì)應(yīng)種屬的二抗（酶標(biāo)二抗），放入濕盒中，室溫孵育30分鐘，使二抗與一抗特異性結(jié)合，然后用PBS沖洗3次，每次5分鐘，去除未結(jié)合的二抗。

7. DAB顯色：按說(shuō)明書(shū)比例混合DAB顯色液（A液+B液），滴加在切片上，室溫下顯微鏡下觀察顯色情況（一般1-5分鐘），當(dāng)目標(biāo)區(qū)域出現(xiàn)棕黃色陽(yáng)性信號(hào)，且背景無(wú)明顯染色時(shí)，立即用自來(lái)水沖洗，終止顯色。

8. 復(fù)染：將切片放入蘇木素染液中，復(fù)染3-5分鐘，使細(xì)胞核染色，自來(lái)水沖洗后，用1%鹽酸酒精分化3秒，再用自來(lái)水返藍(lán)10分鐘。

9. 脫水透明、封片：同HE染色步驟，梯度酒精脫水→二甲苯透明→中性樹(shù)膠封片，晾干后觀察。

10. 結(jié)果判斷：顯微鏡下觀察，陽(yáng)性信號(hào)呈棕黃色，主要定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例判斷表達(dá)水平。

（四）注意事項(xiàng)

1.  抗原修復(fù)需嚴(yán)格把控溫度與時(shí)間，微波爐加熱至沸騰后保持中低火恒溫10分鐘，自然冷卻至室溫，過(guò)度修復(fù)易致組織脫落，修復(fù)不足則抗原暴露不完全，影響結(jié)合效率；

2.  一抗、二抗需按說(shuō)明書(shū)比例用專(zhuān)用稀釋液稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜時(shí)濕盒內(nèi)需加足量蒸餾水保濕，避免切片干燥，孵育時(shí)間不足或抗體濃度不當(dāng)易引發(fā)假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果；

3.  DAB顯色需在顯微鏡下全程監(jiān)測(cè)，待棕黃色陽(yáng)性信號(hào)清晰且背景無(wú)明顯著色時(shí)，立即用自來(lái)水徹底沖洗終止反應(yīng)，顯色過(guò)久會(huì)導(dǎo)致背景染色加深，干擾結(jié)果判讀；

4.  實(shí)驗(yàn)全程需使用新鮮配制的試劑，PBS沖洗要充分，避免殘留試劑相互干擾，同時(shí)保持切片濕潤(rùn)狀態(tài)，防止抗原變性失效。

文章出自：病理檢測(cè)外包      想了解更多請(qǐng)關(guān)注：http://bocs.com.cn/